中科院西安光機(jī)所姚保利研究員團(tuán)隊(duì)在《激光與光電子學(xué)進(jìn)展》發(fā)表題為“光片熒光顯微及應(yīng)用進(jìn)展”的特邀綜述文章，系統(tǒng)介紹了光片熒光顯微成像技術(shù)的基本原理，主要技術(shù)問題及解決方案，列舉了其在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用，討論了該技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì)及前景。

    封面文章|于湘華,劉超,柏晨,楊延龍,彭彤,但旦,閔俊偉,姚保利. 光片熒光顯微成像技術(shù)及應(yīng)用進(jìn)展[J]. 激光與光電子學(xué)進(jìn)展, 2020, 57(10): 100001

    撰稿人|于湘華

背景介紹

    相比經(jīng)典的寬場(chǎng)熒光顯微成像和激光掃描共聚焦顯微成像，光片熒光顯微能夠克服光毒性、光漂白性等缺點(diǎn)，是活體樣品長(zhǎng)時(shí)間三維成像的理想工具。

光片熒光顯微原理如動(dòng)畫1所示。采用正交光路設(shè)計(jì)，用一層薄光片從側(cè)面激發(fā)樣品，并在垂直于光片的方向上利用顯微物鏡和數(shù)字相機(jī)拍攝樣品的二維熒光圖像，通過軸向掃描光片或移動(dòng)樣品逐面成像，即可獲取不同深度處的層析圖像并實(shí)現(xiàn)樣品的三維信息重構(gòu)。

動(dòng)畫1 光片熒光顯微工作原理動(dòng)畫

論文詳解

    01

    光片熒光顯微簡(jiǎn)介

    第一部分，作者對(duì)光片顯微基礎(chǔ)理論做了介紹，主要從光片熒光顯微的特點(diǎn)和光片生成的方法兩方面進(jìn)行了解釋。

    1.1

    光片熒光顯微的特點(diǎn)

    文中將光片熒光顯微成像與傳統(tǒng)落射式熒光顯微成像、激光掃描共聚焦顯微成像做對(duì)比。

    與傳統(tǒng)落射式熒光顯微構(gòu)架不同（如圖1b所示），光片熒光顯微正交獨(dú)立的激發(fā)和探測(cè)光路（如圖1a所示），從側(cè)面用一層薄的光片照明樣品，僅激發(fā)成像物鏡焦面薄層區(qū)域的樣品，在正交方向上進(jìn)行探測(cè)成像，這樣能有效避免離焦背景對(duì)成像質(zhì)量的影響，具有成像對(duì)比度高和天然光學(xué)層析的優(yōu)點(diǎn)。

圖1 兩種顯微成像方式對(duì)比。(a) 光片熒光顯微從側(cè)面用薄光片照明，只激發(fā)探測(cè)物鏡焦平面處的樣品發(fā)射熒光，在正交方向上收集熒光信號(hào)成像；

(b) 落射式熒光顯微用同一物鏡激發(fā)和收集熒光，光束經(jīng)過的在焦和離焦樣品都會(huì)被激發(fā)，會(huì)增大光損傷。

    與激光掃描共聚焦顯微成像相比，光片熒光顯微所需激光能量?jī)H為其的1/1000，且避免了多次重復(fù)不必要的照明激發(fā)，降低了光漂白和光毒性，因而適宜于長(zhǎng)時(shí)間對(duì)對(duì)活體生物樣品進(jìn)行成像。

    1.2

    光片生成的方法

    光片的生成是光片熒光顯微成像技術(shù)的核心。文中從柱面鏡聚焦（如圖2(a)所示）和光束掃描生成 （如圖2(b)所示）兩部分進(jìn)行介紹。柱面鏡聚焦，2004年首次提出使用，但其能量利用率低、限制其他類型光片場(chǎng)生成等缺陷，2008年，光束掃描生成法提出且使用。光束掃描生成法，用掃描振鏡快速掃描激光束，經(jīng)過顯微物鏡聚焦后可生成一個(gè)動(dòng)態(tài)的光片，具有強(qiáng)度分布更均勻，激光能量利用率更高和生成光片種類更豐富的優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用在很多光片熒光顯微成像系統(tǒng)中。

圖2 兩種光片生成方法的光片熒光顯微原理圖。(a) 使用柱面鏡聚焦方法生成光片；(b) 利用振鏡快速掃描光束生成光片。

    02

    光片熒光顯微的主要技術(shù)問題

    第二部分，作者詳細(xì)介紹了光片熒光顯微的主要技術(shù)問題，從四個(gè)方面進(jìn)行了分析：空間分辨率與視場(chǎng)相互制約問題、光學(xué)衍射極限限制超分辨成像問題、成像速度問題、成像質(zhì)量和成像深度問題。

    2.1

    空間分辨率和視場(chǎng)相互制約

    影響光片顯微成像性能的因素：系統(tǒng)的軸向分辨率由探測(cè)物鏡的數(shù)值孔徑與激發(fā)光片的厚度共同決定，視場(chǎng)受限于光片寬度。

    目前的解決方案存在一定弊端：傳統(tǒng)高斯光片場(chǎng)的厚度和寬度會(huì)隨著柱面鏡焦距的增大或照明物鏡的數(shù)值孔徑的減小而增大，大的視場(chǎng)通常以犧牲軸向分辨率和三維層析成像能力為代價(jià)。通過掃描具有無衍射特性的貝塞爾光束、艾里光束等生成新型光片場(chǎng)，可以擴(kuò)大光片熒光顯微系統(tǒng)觀測(cè)視場(chǎng) (動(dòng)畫2所示)。然而貝塞爾光束的同心環(huán)狀旁瓣產(chǎn)生的離焦背景噪聲，既降低成像對(duì)比度和系統(tǒng)軸向分辨率，又增大了光漂白和光毒性效應(yīng)。

    為了解決上述問題，作者團(tuán)隊(duì)提出了互補(bǔ)光束相減光片熒光顯微成像技術(shù)，原理如圖3所示，分別用貝塞爾光片和互補(bǔ)光片照明樣品拍攝兩幅熒光圖像，然后將兩幅圖像相減，可消除貝塞爾光束旁瓣對(duì)成像結(jié)果的影響，從而實(shí)現(xiàn)大視場(chǎng)高軸向分辨率成像^{[1, 2]}。

圖3 無衍射互補(bǔ)光束相減光片熒光顯微的原理圖

    2.2

    突破光學(xué)衍射極限實(shí)現(xiàn)超分辨成像

    2.3

    提高成像速度

    2.4

    提高成像質(zhì)量和成像深度

    03

    光片熒光顯微的主要應(yīng)用

    在細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域，光片熒光顯微可用于研究細(xì)胞內(nèi)分子擴(kuò)散規(guī)律與機(jī)制、大分子間相互作用、細(xì)胞與細(xì)胞之間的相互作用等各種生理規(guī)律，是細(xì)胞生物學(xué)研究領(lǐng)域中非常重要的顯微成像工具，如圖4所示。

圖4 光片熒光顯微用于觀察細(xì)胞有絲分裂[3]

    在發(fā)育生物學(xué)領(lǐng)域，光片熒光顯微具有光損傷低和快速三維層析成像的優(yōu)勢(shì)，適宜于對(duì)發(fā)育中的生物體進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間顯微成像。它已經(jīng)成功用于對(duì)斑馬魚、果蠅、秀麗隱桿線蟲等模式動(dòng)物的胚胎發(fā)育過程的長(zhǎng)時(shí)間三維顯微成像，如圖5所示。

圖5 光片熒光顯微用于觀察斑馬魚和果蠅胚胎發(fā)育[4]

    在神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域，對(duì)整個(gè)大腦進(jìn)行細(xì)胞或亞細(xì)胞尺度分辨率的三維無創(chuàng)顯微成像，獲取全部神經(jīng)元的位置、形態(tài)和行為信息，有利于研究神經(jīng)回路進(jìn)而理解腦內(nèi)過程和神經(jīng)機(jī)制。光片熒光顯微是實(shí)現(xiàn)小型脊椎動(dòng)物和無脊椎動(dòng)物全腦成像的出色工具，如圖6所示。

    總結(jié)與展望

    光片熒光顯微成像技術(shù)具有高空間分辨率、低損傷、快速和三維層析成像的特點(diǎn)，已成功應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)、發(fā)育生物學(xué)和神經(jīng)科學(xué)等領(lǐng)域，是對(duì)活體生物樣品進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間三維成像的理想工具。實(shí)現(xiàn)更深的成像深度、更高的空間分辨率和更快的成像速度仍然是光片熒光顯微技術(shù)面臨的挑戰(zhàn)。自適應(yīng)光學(xué)技術(shù)以及近紅外熒光標(biāo)記可以幫助提高成像深度，并行化光片熒光架構(gòu)可以進(jìn)一步提高成像速度，結(jié)合實(shí)時(shí)的計(jì)算圖像分析方法和光學(xué)微操縱技術(shù)可以使其成為數(shù)據(jù)驅(qū)動(dòng)的微觀世界互動(dòng)平臺(tái)，為人們探索生命的奧秘提供更有利的工具。

    參考文獻(xiàn)

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原文鏈接：《【封面】姚保利：活體樣品的長(zhǎng)時(shí)間三維成像——光片熒光顯微術(shù)》

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