一、引子

  今年春節(jié)前后，一場突如其來的新冠肺炎病毒疫情從武漢席卷全國。令人敬佩的千千萬萬醫(yī)務(wù)工作者和防疫人員奮戰(zhàn)在抗擊疫情的最前線。作為普通人，我們蹲在家里，不給國家添亂，默默祝愿疫情早日結(jié)束，并衷心祝福武漢，祝福湖北盡快恢復(fù)過來，所有普通人的生活能回歸正軌。

  我們希望將多年的光學(xué)顯微鏡經(jīng)驗，寫下這篇科普小短文，做為這段艱難時光的一點紀(jì)念。也希望疫情好轉(zhuǎn)后能和大家分享。

二、光學(xué)顯微鏡

  從16世紀(jì)末荷蘭眼鏡商人詹森父子發(fā)明世界第一臺光學(xué)顯微鏡以來，顯微鏡就成為人們認(rèn)識微觀世界，推動生命科學(xué)進(jìn)步的最主要工具。其后與牛頓同時代的英國著名科學(xué)家羅伯特胡克，以及第一個用顯微鏡觀察到細(xì)菌等微生物的荷蘭科學(xué)家列文虎克都對顯微鏡的制造和應(yīng)用做出過極其重要的歷史貢獻(xiàn)。三百多年來隨著科技進(jìn)步，現(xiàn)代的高端寬場熒光顯微鏡和激光共聚焦熒光顯微鏡更是可以看清小至單個大細(xì)菌（1-5 μm左右）和單個細(xì)胞（10-100 μm左右），甚至亞細(xì)胞的尺度（圖1），極大推動了現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)的基礎(chǔ)研究，做出了卓越貢獻(xiàn)。

  但是光學(xué)顯微鏡也有局限性，19世紀(jì)德國的物理學(xué)家阿貝提出了顯微鏡衍射成像理論，得出了一個重大基本法則，即無論如何提高光學(xué)顯微鏡透鏡的制造水平，它的xy平面分辨率（下同）都無法突破一個極限， 這個極限大約為最短可見光-----紫光波長的一半，約為200 nm左右(紫光波長約為400 nm）。即無論如何發(fā)展，最好的基于透鏡的傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡也無法看清分辨出比200 nm更小的物體。因此對于尺寸更小的病毒和生物分子，光學(xué)顯微鏡就無能為力了。

圖 1

三、病毒

  這次肆虐神州的新型冠狀病毒又勾起我們?nèi)祟愅纯嗟挠洃?。自古以來，人類就在和病毒進(jìn)行不斷的斗爭，如古代的天花、牛痘，最近幾十年冒出的艾滋病毒、SARS病毒、禽流感病毒、埃博拉、H1N1甲型流感病毒等，造成人類的各種嚴(yán)重疾病甚至導(dǎo)致疾病的大規(guī)模流行，引起全球恐慌。

圖 2

  病毒是目前已知的地球上最簡單的生命單元，不同于一般的細(xì)胞生物，它沒有完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)。通常它是由外殼蛋白和包被在外殼蛋白內(nèi)的遺傳物質(zhì)（DNA或RNA，統(tǒng)稱核酸）兩部分組成。由于本身缺乏完整生命過程需要的酶系統(tǒng)及能量轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，當(dāng)病毒游離于環(huán)境中時，它只是一個有機大分子，不能長時間存活，只有侵染宿主后才具有生命特征，進(jìn)行復(fù)制傳代。它依靠的宿主可以是簡單的細(xì)菌，比如最簡單、最古老的病毒叫噬菌體，它是感染細(xì)菌的病毒（圖2），也可以感染人類這樣復(fù)雜的生物體的細(xì)胞。

  病毒感染宿主細(xì)胞是一個非常復(fù)雜的過程，通俗講，它必須寄生到一個細(xì)胞里面才能實現(xiàn)病毒的“傳宗接代”。如圖3，病毒依靠外殼蛋白特異性結(jié)合到宿主細(xì)胞表面，注入病毒遺傳物質(zhì)到細(xì)胞內(nèi)，利用宿主細(xì)胞來大量復(fù)制病毒遺傳物質(zhì)并且制造外殼蛋白，在宿主細(xì)胞內(nèi)重新包裝成完整病毒，然后破細(xì)胞而去進(jìn)一步感染別的健康細(xì)胞，而原宿主細(xì)胞死亡。

圖 3

  人類對病毒的認(rèn)知卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)晚于并且小于對細(xì)胞和其它微生物（如細(xì)菌），最主要的原因是病毒太小了。和正常細(xì)胞（10-100 μm）或細(xì)菌（幾微米）相比，一般病毒在100 nm 左右（從二十到幾百納米不等），和它感染的人類細(xì)胞相比，相當(dāng)于北京鳥巢體育場里站著的一個人。 雖然它廣泛存在著，但憑借普通光學(xué)顯微鏡根本看不見它。十九世紀(jì)末，俄國科學(xué)家伊萬諾夫斯基就在研究煙草花葉病時發(fā)現(xiàn)了病毒的存在，但 “病毒”的形態(tài)結(jié)構(gòu)卻要等到20世紀(jì)30年代后隨著電子顯微鏡的發(fā)明才被人類所逐步認(rèn)識。

四、電鏡

  進(jìn)入到20世紀(jì)30年代，人們對更小的微觀世界的追求促進(jìn)了電鏡的發(fā)明。德國科學(xué)家Ernst Ruska（1986年度諾貝爾物理學(xué)獎獲得者）發(fā)明了透射電子顯微鏡，利用加速電壓產(chǎn)生的電子波長遠(yuǎn)小于可見光的波長，從而使電子顯微鏡能達(dá)到遠(yuǎn)超于普通光學(xué)顯微鏡2-3個數(shù)量級的分辨率。電子的德布羅意波長由加速電壓決定，加速電壓越大，電子波長越短，目前最高分辨率的透射電鏡可達(dá)到0.1 nm的分辨率。與可見光顯微鏡分辨率約200 nm的極限相比，其分辨率提高了約2000倍。

  因此，通過電子顯微鏡人們發(fā)現(xiàn)了許多以往光學(xué)顯微鏡看不到的生物結(jié)構(gòu)，如病毒（20-200 nm,平均100 nm左右），小的細(xì)胞器（如核糖體、高爾基體等），大分子（蛋白質(zhì)、DNA/RNA、從幾個納米到幾十個納米），這也讓電鏡成為病毒形態(tài)學(xué)研究最主要的工具。目前肆虐神州，令我們深惡痛絕的新型冠狀病毒的樣子就是從電鏡中看到的直徑大約100 nm花冠樣的結(jié)構(gòu)（如圖4）。

圖 4（圖片來自國家病原微生物資源庫）

  和別的技術(shù)一樣傳統(tǒng)電鏡也有它的局限性，由于傳統(tǒng)電鏡產(chǎn)生的電子散射對于蛋白質(zhì)和水沒有太大的差異，這就需要在研究細(xì)胞時，對樣品進(jìn)行脫水和樣品染色等處理，用來增加襯度（對比度），這種處理會損傷樣品原來的生物學(xué)性狀。同時為了避免對電子束的干擾，常規(guī)的電鏡觀測樣本必須在真空中，這些因素導(dǎo)致電子顯微鏡難以研究活的生物細(xì)胞。另外，透射電子顯微鏡觀測到的是三維物體的二維投影，不能獲得樣品內(nèi)部的三維結(jié)構(gòu)。

  為了克服傳統(tǒng)生物樣品應(yīng)用于電鏡時的制樣損傷，上個世紀(jì)70年代，科學(xué)家發(fā)明了冷凍電鏡。這一樣品制備技術(shù)將含有生物大分子的原溶液迅速冷凍于零下196℃的液氮中，減少冰晶形成，保有其生物性狀的同時進(jìn)而降低高能電子對生物標(biāo)本輻照損傷。美國的A. C. Steven實驗室和英國的R. A. Crowther實驗室于1997年在Nature同期發(fā)表了文獻(xiàn)，第一次報告了用冷凍電鏡觀察到的病毒的亞納米結(jié)構(gòu)（圖5）。最近十多年冷凍電鏡技術(shù)屢有重大突破，其中三維生物冷凍電鏡技術(shù)成為研究蛋白及病毒結(jié)構(gòu)、分布與功能的重要手段。該技術(shù)的發(fā)明人也因此獲得2017年諾貝爾化學(xué)獎。

圖 5（原片來自A. C. Steven實驗室于1997年發(fā)表在Nature的乙肝病毒，標(biāo)尺5nm）

五、熒光顯微鏡

  可以講，無論是傳統(tǒng)電鏡還是最近火爆的冷凍電鏡，由于分辨率優(yōu)勢，都對深入解析病毒的結(jié)構(gòu)起到了極其重要的作用。但由于工作原理，電鏡使用還存在以下限制：

1.傳統(tǒng)電鏡需要對生物樣品進(jìn)行固定、包埋、切片以及重金屬染色等繁瑣的過程，標(biāo)本必須是超薄固定。

2.由于電子有限的穿透深度，無論哪種電鏡，都不能用于較厚的樣品成像（不到1μm）。

3.電鏡成像實際上只是對附著于生物大分子表面的重金屬染料成像，這種重金屬染料沒有生物特異性標(biāo)記能力，所以無法區(qū)分結(jié)構(gòu)功能不同的生物分子。

4.由于制樣限制，無論哪種電鏡，都無法獲取生物過程的動態(tài)信息。

  從人類與病毒作斗爭的漫長歷史來看，人類研究病毒最主要的目的還是尋找攻克病毒造成疾病的方法，這就必須深入探究病毒感染宿主的詳細(xì)機制。也就是除了研究病毒自身結(jié)構(gòu)功能外，必須進(jìn)一步研究病毒與感染細(xì)胞之間的動態(tài)過程，哪怕這種動態(tài)過程是以靜態(tài)連續(xù)展現(xiàn)出來的。

  正因如此，科學(xué)家在使用電子顯微鏡研究病毒幾十年后，又將目光重新放回操作簡單方便易用的光學(xué)顯微鏡身上。我們知道，之所以光學(xué)顯微鏡不受病毒學(xué)研究青睞，最主要的原因就是光學(xué)顯微鏡先天的分辨率低（無法直接分辨200 nm以下的目標(biāo)），從而無法滿足對病毒（通常小于100 nm）的成像，更不要說直接觀察病毒在活細(xì)胞內(nèi)的感染，復(fù)制和釋放過程了。而現(xiàn)在，由于技術(shù)的進(jìn)步和創(chuàng)新，這一問題可以通過熒光標(biāo)記（見下）和超分辨率熒光顯微鏡（見六）來有效的解決。

  熒光標(biāo)記是將病毒標(biāo)記上熒光分子之后，觀察可被光學(xué)顯微鏡分辨出的螢光團(tuán)，利用熒光標(biāo)記物的放大作用，來間接地觀察我們看不見的病毒這樣就能使病毒的感染過程可視化，就能夠動態(tài)追蹤病毒在細(xì)胞或宿主體內(nèi)的復(fù)制、擴散等生命活動。圖6展示了多種利用熒光基團(tuán)來標(biāo)記病毒的策略。

  從上世紀(jì)末以來，以綠色熒光蛋白GFP為代表的多種熒光蛋白陸續(xù)實用化，各種新型熒光染料標(biāo)記物（肽/蛋白標(biāo)簽、有機染料、量子點以及熒光素酶）的產(chǎn)生， 和以共聚焦顯微鏡為代表的各種高端熒光顯微鏡的廣泛使用，使得對目標(biāo)中不同的分子進(jìn)行特異性多色標(biāo)記（圖6），從而實時動態(tài)觀察病毒感染宿主細(xì)胞過程變?yōu)榭赡?，極大的改變了傳統(tǒng)病毒研究中電鏡一家獨大的局面，補充了許多電鏡手段無法觀測到的生物醫(yī)學(xué)內(nèi)涵。

圖 6（圖片來自Winfried F. Pickl實驗室于2013年發(fā)表在Sensors的綜述）

下面給出幾個例子:

圖 7

  圖8中，用間接免疫熒光方法和共聚焦顯微鏡觀察到，綠色熒光標(biāo)記了其結(jié)構(gòu)蛋白的SARS病毒團(tuán)與受感染細(xì)胞中的核蛋白（用紅色熒光標(biāo)記）在細(xì)胞核區(qū)共定位的情況。

圖 8

  圖9是艾滋病HIV-1病毒感染免疫T細(xì)胞的動態(tài)過程.綠色小點是HIV1的結(jié)構(gòu)蛋白Gag-GFP，用來示蹤病毒團(tuán)從一個受感染細(xì)胞（綠色）侵入另一個健康細(xì)胞（紅色）的過程。

圖 9

六、超分辨顯微鏡

  無論是最普通的光學(xué)顯微鏡，高端寬場熒光顯微鏡還是激光共聚焦熒光顯微鏡，受制于我們前面介紹的阿貝衍射定律，存在一個光學(xué)的分辨率極限，無法像電鏡一樣大幅度提高其分辨率。但能否另辟蹊徑來提高光學(xué)顯微鏡的分辨率呢?從上世紀(jì)的八十年代以來，科學(xué)家們嘗試了不同的方法,利用熒光發(fā)光的某些機制，規(guī)避繞開了傳統(tǒng)衍射極限限制，從而在光學(xué)顯微鏡上最終實現(xiàn)了超越200 nm極限的分辨率。

  真正的突破要從1994年德國馬克斯普朗克研究所Stefan W. Hell發(fā)明STED超高分辨率方法開始。從那以后的20多年里，各國科學(xué)家發(fā)明了一系列打破光學(xué)衍射極限的熒光超分辨技術(shù)，可以使熒光顯微鏡的分辨率提高2～10倍，目前最高可以在三維上提高兩個數(shù)量級即百倍（MINFLUX）。為在納米尺度上三維動態(tài)的研究亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)功能病毒機理,生物大分子作用等，提供了的前所未有的有效手段。因此包括Stefan W. Hell在內(nèi)的三位對超分辨熒光顯微鏡研發(fā)做出杰出貢獻(xiàn)的科學(xué)家被授予2014年諾貝爾化學(xué)獎。

  目前，超分辨顯微鏡技術(shù)可分為三大類（見圖10）：

  第一類是基于單分子定位的顯微成像技術(shù)（Single Molecule Localization Microscopy,SMLM,例如PALM/STORM）。此前分辨率極限的根本原因是在衍射極限范圍內(nèi)，熒光基團(tuán)同時發(fā)光，相互位置又過于靠近，從而無法被傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡同時分辨。因此如果能在時間和空間上隔開記錄這些光點，分開辨識，就可以隨后組合出超分辨率的圖像。此類方法通過一些光學(xué)技巧例如光控開關(guān)熒光分子，可以實現(xiàn)短時間內(nèi)只有極少量甚至單個熒光分子發(fā)光并被探測到，相機記錄下其位置，此過程重復(fù)成千上萬次，記錄下千千萬萬個來自樣品的發(fā)光點，然后再利用數(shù)學(xué)定位算法重組出高分辨圖像，可以說是一種以犧牲時間換取空間分辨率的方法（圖10A）。

  第二類是以受激發(fā)射損耗顯微鏡(STimulated Emission Depletion microscopy, STED)為代表的模式光照明成像方法。這種技術(shù)在正常用于熒光激發(fā)的衍射極限激光圓斑上，重疊一個同心中空的特殊激光環(huán)（即損耗激光環(huán)），來同步照射熒光染色樣品，圖10B。處于圓心部分的樣品熒光基團(tuán)由于沒有損耗激光環(huán)重疊，可以正常被激發(fā)并發(fā)射熒光。周邊重疊部分的熒光基團(tuán)被正常激發(fā)后，在正常產(chǎn)生熒光之前，由于損耗激光環(huán)的存在而迅速從激發(fā)態(tài)被強行拉回到基態(tài)，從而剝奪正常的熒光發(fā)射能力，形成一個環(huán)形暗區(qū)。損耗激光環(huán)的強度越大，形成的暗區(qū)越大，這種組合方式可以使得圓心處的有效熒光分辨率大大低于衍射極限，實現(xiàn)極高的分辨率。

  第三類是結(jié)構(gòu)光照明技術(shù)（Structure Illumination Microscopy, SIM）。通過在照射樣品時，按特定方式引入含有特定頻譜信息的結(jié)構(gòu)化照明遮罩，來采集圖像，之后利用相符合的數(shù)學(xué)算法解析出分辨率低于衍射極限的樣品圖像 （圖10C）。

圖 10

  目前商品化的單分子定位和STED的方法最高可以實現(xiàn)20 nm分辨率水平。商品化的結(jié)構(gòu)光照明技術(shù)能實現(xiàn)的分辨率通常不能突破100 nm。因此對于平均尺寸在100 nm左右的病毒研究來講，與共聚焦顯微鏡（一般220 nm分辨率）相比結(jié)構(gòu)光照明技術(shù)優(yōu)勢并不明顯，所以目前我們能看到用于超分辨研究病毒的文獻(xiàn)主要還是集中在前兩種方法，這兩種方法里顯然STED方法更有優(yōu)勢， 因為單分子定位技術(shù)整體出圖時間較長，不適合研究病毒感染細(xì)胞及復(fù)制、組裝、釋放等動態(tài)過程的研究。（圖11中為自適應(yīng)照明 MINFIELD STED觀察到的HIV-1病毒顆粒）

圖 11 MINFIELD STED 超高分辨率與共聚焦下HIV-1艾滋病病毒顆粒

  圖12反應(yīng)了不同顯微觀察方法下單獨的HIV-1病毒顆粒。(A)電鏡圖可清晰看到靜態(tài)的病毒形態(tài)，包括衣殼（蛋白）包裹著電子致密區(qū)（核相關(guān)蛋白位置）,但病毒表面的Env蛋白無法特異顯示出來。 (B)HIV-1 病毒顆粒的假想圖。(C)共聚焦模式下的HIV-1病毒顆粒表面的Env蛋白（紅色，比較模糊）。(D)與(E)顯示同樣的病毒顆粒在超分辨模式（大約40 nm分辨率水平）下觀察，可清晰地展示Env蛋白(紅色)在病毒顆粒表面的分布，綠色背景是病毒核相關(guān)蛋白Vpr（標(biāo)尺: A-B為50 nm， C-E為100 nm）。

圖 12

  HIV-1病毒尺寸約為直徑140 nm的球形，其本身已經(jīng)小于光學(xué)衍射分辨率極限，更不用說其表面的蛋白。從圖13（標(biāo)尺均為100 nm）中我們可清晰地看出STED超分辨方法采集的HIV病毒表面Env蛋白的分布及數(shù)目。而共聚焦顯微鏡對同種蛋白成像受制于分辨率限制，完全不能解析出同樣的生物學(xué)信息，并且而產(chǎn)生尺寸失真（任何小于分辨率的物體無論大小看上去都是分辨率大?。?。

圖 13

  通過上面的分析，我們知道超分辨顯微鏡在病毒研究鄰域應(yīng)用廣闊。最近幾年，諾獎得主Stefan W. Hell的團(tuán)隊在已有基礎(chǔ)上將STED技術(shù)發(fā)展到更高分辨率水平（20 nm），更多熒光標(biāo)記（4色）的活細(xì)胞實時成像，并且在三維超分辨率上也有突破 （70x70x70 nm）。在全面深入研究病毒感染活細(xì)胞的機制，以及病毒與宿主復(fù)雜時空相互作用中發(fā)揮關(guān)鍵性作用。

  令人興奮的是2017年初，Stefan W. Hell團(tuán)隊在《科學(xué)》上報道了MINFLUX超分辨率熒光顯微鏡，這個技術(shù)結(jié)合STED光照形式和單分子定位熒光特點，實現(xiàn)對生物標(biāo)本的觀察達(dá)到三維上小于2 nm的目前最高空間分辨率（圖14），已經(jīng)將光學(xué)顯微鏡的分辨率水平提升到一般透射電鏡的水平，是共聚焦顯微鏡的100倍，成為真正名副其實的“顯納鏡”。

圖 14（下圖1，2，3中標(biāo)尺為50 nm）

  我們相信隨著該技術(shù)商品化以及大規(guī)模應(yīng)用后，“顯納鏡”既可以像電鏡一樣真正“看清”病毒結(jié)構(gòu)，同時又能方便直觀的觀察到它清晰感染細(xì)胞的過程，為科學(xué)家找到降伏病毒，造福人類的終極手段。冬天即將過去，春天的腳步已經(jīng)越來越近，希望人類永遠(yuǎn)遠(yuǎn)離病毒的毒害。

原文鏈接：光學(xué)超分辨成像，讓病毒“無處遁形”（OESHOW 光電匯）

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